双歧杆菌计数测定

发布时间：2026-08-28 21:19:40 • 阅读量： • 来源：中析研究所

技术概述

双歧杆菌计数测定是微生物检测领域的一项关键技术，主要用于评估食品、保健品、药品以及部分环境样品中双歧杆菌属细菌的活菌数量。作为一种典型的厌氧菌，双歧杆菌在人体肠道健康中扮演着至关重要的角色，被誉为“肠道卫士”。由于其严格的厌氧特性和对生长环境的苛刻要求，该菌的计数测定相比一般需氧菌更具挑战性，需要专业的检测技术和严谨的操作流程。

从微生物学的角度来看，双歧杆菌属于放线菌门，是一类不产芽孢、不运动的革兰氏阳性杆菌。在显微镜下，其形态多变，常呈现Y形、V形或弯曲状，这种独特的形态学特征也是初步鉴定的重要依据。在实际检测中，计数测定的核心目标不仅在于确认样品中是否含有双歧杆菌，更在于精确量化其活菌浓度（通常以CFU/g或CFU/mL表示）。这是因为双歧杆菌的功效往往具有剂量依赖性，只有当摄入的活菌数量达到一定阈值时，才能发挥调节肠道菌群、抑制病原菌生长、增强免疫力等生理功能。

技术层面上，双歧杆菌计数测定主要依据国家标准、行业标准或国际通用标准进行。目前主流的检测方法包括平板计数法、最大可能数法（MPN法）以及近年来兴起的分子生物学方法。其中，平板计数法因其直观、可追溯性强而被广泛应用，但其技术难点在于如何创造并维持严格的厌氧环境。在培养过程中，双歧杆菌对氧气极为敏感，微量的氧气即可抑制其生长甚至导致菌体死亡。因此，检测过程中必须使用厌氧罐、厌氧工作站或加入还原剂的专用培养基，以降低氧化还原电位，模拟肠道内的厌氧环境。

此外，随着生物技术的飞速发展，传统的培养计数法正在与现代分子检测技术相结合。实时荧光定量PCR（qPCR）等技术能够快速特异性地检测双歧杆菌的基因拷贝数，大大缩短了检测周期。然而，由于DNA在细菌死亡后仍可残留，分子方法在区分“活菌”与“死菌”方面存在局限，因此传统的活菌培养计数法依然是评价益生菌产品活性的“金标准”。综上所述，双歧杆菌计数测定是一项融合了微生物学、生物化学和分析化学的综合性技术，其准确性和可靠性直接关系到相关产品的质量控制与功效评价。

检测样品

双歧杆菌计数测定的适用范围非常广泛，涵盖了从原料到成品的多个环节。样品的类型直接决定了前处理的方式和检测的具体难点。根据样品的基质不同，通常可以将检测样品分为以下几大类：

乳制品及发酵乳：这是最常见的检测样品类型，包括酸奶、发酵乳饮料、乳酸菌饮品、奶酪等。此类样品中含有丰富的营养物质，双歧杆菌常作为发酵剂或益生菌添加剂加入。由于乳制品基质相对均一，样品的前处理相对简单，但需注意样品的保存温度和检测时效，以免菌株活性下降。
保健食品（益生菌制剂）：主要包括固态的胶囊、片剂、粉剂（冲剂）以及液态的口服液等。此类产品通常标注了具体的活菌数，且往往采用冻干粉技术以提高菌株存活率。检测时需重点关注如何使冻干菌粉充分复水、溶解，以及如何消除辅料（如淀粉、胶囊壳）对计数结果的干扰。
婴幼儿配方食品及辅助食品：由于双歧杆菌是婴儿肠道内的优势菌群，许多婴幼儿奶粉、米粉中都会添加双歧杆菌。此类样品的检测要求极高，不仅要准确定量，还要确保检测过程中无外源微生物污染，同时需排除奶粉中其他添加成分对选择培养基的干扰。
功能性食品与饮料：包括各类声称具有调节肠道功能的固体饮料、发酵果蔬汁、酵素产品等。这类样品基质复杂，可能含有多种酶类、有机酸或植物提取物，这些成分可能抑制细菌生长或改变培养基的理化性质，因此在检测前需进行适当的稀释或中和处理。
饲料及饲料添加剂：随着替抗行动的推进，益生菌饲料添加剂的应用日益广泛。检测此类样品中的双歧杆菌含量，是评估饲料品质和动物营养调控效果的重要指标。
菌粉原料：作为生产益生菌产品的核心原料，高纯度的双歧杆菌菌粉对计数测定提出了极高的精度要求。由于原料中活菌含量极高（通常达到千亿级别），稀释梯度大，操作误差容易被放大，因此需要更加精细的稀释操作。

针对不同类型的样品，实验室在接收后会立即进行状态确认，并依据相关标准进行严格的前处理。对于液态样品，通常直接进行梯度稀释；对于固态样品，则需使用无菌稀释液（如蛋白胨水、生理盐水或磷酸盐缓冲液）进行均质、溶解，制成均匀的悬液后，方可进行后续的接种培养。

检测项目

双歧杆菌计数测定的核心检测项目是“双歧杆菌活菌数”，但在实际质量控制体系中，为了全面评估样品的品质，往往还包含一系列相关联的检测项目。这些项目共同构成了一个完整的评价体系，确保检测结果的科学性和产品合规性。

双歧杆菌活菌计数：这是最核心的项目。通过选择性培养基，在适宜的温度和严格的厌氧条件下培养，计数生长出的典型菌落数。结果通常以每克或每毫升样品中的菌落形成单位（CFU）表示。此项数据直接反映了益生菌产品的有效成分含量，是判定产品是否合格的关键指标。
菌种鉴定与确认：在计数的同时，还需要确认培养出的菌落是否确实为双歧杆菌。这包括形态学观察（显微镜下观察菌体形态、排列方式）和生化鉴定。常用的生化鉴定项目包括过氧化氢酶试验（双歧杆菌通常为阴性）、革兰氏染色（阳性）以及特定的糖发酵试验。必要时，需采用分子生物学方法（如16S rRNA基因测序）进行种水平的精确鉴定，以确保产品中添加的菌株与标签标识一致。
杂菌计数与微生物限量检测：为了评估益生菌产品的卫生状况，在计数双歧杆菌的同时，还需要检测样品中的杂菌总数（菌落总数）、霉菌和酵母计数、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌。这有助于判断生产环境的洁净度以及是否存在二次污染。
水分活度与pH值测定：虽然不是直接的微生物计数，但水分活度和pH值是影响双歧杆菌存活的关键理化指标。特别是对于粉剂和固体饮料，过高的水分活度会导致菌体代谢加速而死亡；过低的pH值则可能抑制菌体生长。测定这些参数有助于解释计数结果异常的原因。
稳定性试验：针对成品，常需进行加速稳定性试验和长期留样观察，定期检测双歧杆菌的存活率，以确定产品的保质期。这是研发阶段和质量控制中不可或缺的项目。

通过上述多项检测的综合分析，可以全面掌握双歧杆菌产品的微生物安全性和活性功能指标，为产品放行、市场流通和消费者使用提供坚实的数据支撑。

检测方法

双歧杆菌计数测定的方法选择至关重要，不同的方法在准确性、时效性和成本上各有优劣。目前，国内外主流的检测方法主要分为传统培养法和现代快速检测法两大类。

一、平板计数法（国标法）

这是目前最权威、应用最广泛的方法，也是我国食品安全国家标准GB 4789.34《食品微生物学检验双歧杆菌检验》推荐的方法。其基本原理是利用双歧杆菌对某些抗生素（如莫匹罗星、锂盐等）的耐受性，在培养基中加入这些抑制剂制备选择性培养基（如改良MRS培养基、BBL培养基等），从而抑制其他杂菌生长，只允许双歧杆菌形成菌落。具体操作流程如下：

样品制备：称取或量取样品，加入无菌稀释液进行系列10倍梯度稀释。
接种与培养：选择2-3个适宜稀释度的样品匀液，接种于选择性培养基平板上（涂布法或倾注法）。
厌氧环境构建：将接种后的平板置于厌氧培养罐或厌氧工作站中，放入催化剂和产气袋（如厌氧气袋），通过化学反应消耗氧气并产生二氧化碳和氢气，构建厌氧环境。
培养条件：在36℃±1℃条件下培养48小时±2小时，必要时可延长至72小时。
菌落计数与鉴定：计数平板上的典型菌落（通常为白色、光滑、圆形、边缘整齐），并挑取部分菌落进行显微镜检查和生化确认。

二、最大可能数法（MPN法）

当样品中双歧杆菌数量较低或分布不均匀，或者样品基质对平板法有严重干扰时，可采用MPN法。该方法基于统计学原理，通过将样品接种到一系列含有液体培养基的试管中，根据生长阳性试管的数量查MPN表，推算出样品中的含菌量。MPN法虽然精确度不如平板法，但适用于低浓度菌液的检测，且操作相对灵活。

三、荧光定量PCR法

随着分子生物学技术的发展，qPCR法逐渐被应用于双歧杆菌的快速检测。该方法针对双歧杆菌的特异性基因序列（如16S rRNA基因的特异性片段或hsp60基因）设计引物和探针，通过检测扩增产物的荧光信号强度进行定量。qPCR法具有检测速度快（几小时内出结果）、特异性强、灵敏度高的优点，非常适合于大批量样品的快速筛查。然而，该方法最大的局限在于无法有效区分活菌和死菌（死菌DNA也会被扩增），导致结果可能偏高。为了解决这一问题，目前结合了叠氮溴化丙锭（PMA）或叠氮溴化乙锭（EMA）染料的前处理技术被引入，这些染料能选择性穿透死菌细胞膜并结合DNA，从而抑制死菌DNA的扩增，实现活菌计数的模拟。

四、流式细胞术

这是一种基于物理特性的快速计数方法。通过特异性荧光染料（如SYTO 9和碘化丙啶PI）对细菌进行染色，利用流式细胞仪对细胞逐个进行检测。该方法能够快速区分活菌、死菌以及细胞碎片，检测速度极快，非常适合发酵过程的实时监控和工业生产中的在线质控。但流式细胞仪设备昂贵，且对样品中的颗粒杂质敏感，需要样品前处理非常纯净。

在实际检测中，实验室通常优先采用平板计数法作为仲裁方法，而在需要快速筛查或科研分析时，辅助使用分子生物学方法或流式细胞术，以确保检测结果的准确性与时效性。

检测仪器

准确的双歧杆菌计数测定离不开专业化的精密仪器设备。实验室的硬件配置直接决定了检测能力和结果的可靠性。以下是进行双歧杆菌计数测定所必需的关键仪器设备：

厌氧培养系统：这是双歧杆菌检测最核心的设备。主要包括厌氧工作站（Glove Box）和厌氧培养罐。厌氧工作站提供了一个全封闭的厌氧操作空间，检测人员通过手套在箱内进行接种、划线等操作，避免了菌种暴露于空气中的风险，是进行厌氧菌检测的高端配置。厌氧培养罐则配合厌氧产气包使用，成本较低，适合中小型实验室。
微生物限度检验仪/均质器：用于样品的前处理。均质器（如拍打式均质器）能将固体样品与稀释液快速混合均质，确保细菌从样品基质中充分释放出来，这对保证计数结果的准确性至关重要。
恒温培养箱：双歧杆菌的最佳生长温度通常为36℃-37℃。实验室需配备高精度的恒温培养箱，温度波动需控制在±1℃以内。部分培养箱具备二氧化碳控制功能，更有利于双歧杆菌的生长。
全自动菌落计数仪：针对大量样品的检测，全自动菌落计数仪能够通过高分辨率摄像头拍摄平板图像，并利用软件算法自动识别和计数菌落，大大提高了工作效率，减少了人工计数的主观误差。
光学显微镜：用于菌落形态的初步观察和革兰氏染色鉴定。配备相差显微镜或荧光显微镜可进一步提升观察效果。
PCR仪及电泳系统：用于分子生物学鉴定。普通PCR仪用于扩增特定基因片段，电泳系统用于观察扩增结果。若进行定量检测，则需配置实时荧光定量PCR仪。
高压蒸汽灭菌器：用于培养基、稀释液、器皿的灭菌，确保检测过程无菌。双歧杆菌检测所用培养基往往含有明胶、琼脂等成分，需特定的灭菌程序以避免破坏营养成分。
生物安全柜：提供百级洁净度的操作环境，保护操作人员免受潜在病原菌感染，同时也保护样品免受环境污染。
酸度计（pH计）：用于调节和监控培养基及样品悬液的pH值，因为双歧杆菌对pH值敏感，适宜的酸碱度是其生长的必要条件。

先进的仪器设备是高质量检测的基础。实验室不仅要配备上述仪器，还需建立完善的仪器维护保养体系，定期进行校准和性能验证，确保所有设备处于良好的运行状态，从而保障检测数据的准确性和可重复性。

应用领域

双歧杆菌计数测定在多个行业领域发挥着不可替代的作用，其检测数据是产品质量控制、科学研究和法规监管的重要依据。随着大健康产业的蓬勃发展，该检测技术的应用场景也在不断拓展。

1. 食品饮料行业

这是应用最广泛的领域。在发酵乳制品（如酸奶、开菲尔）、益生菌饮料、婴幼儿配方奶粉以及功能性食品的生产过程中，双歧杆菌是核心功能成分。生产企业需要在出厂检验中进行计数测定，确保产品中的活菌数达到标签标示值和国家标准要求。例如，我国标准规定低温酸奶中的益生菌含量在保质期内需达到一定数量（通常为10^6 CFU/g以上）。通过严格的计数测定，企业可以监控发酵工艺、优化冷链储运条件，从而保证产品的市场竞争力。

2. 保健食品与药品行业

益生菌类保健食品和微生态制剂药品在上市前必须经过严格的注册检验。双歧杆菌计数测定是稳定性考察、功效成分测定和质量标准制定的关键内容。无论是胶囊、片剂还是散剂，都需要通过检测验证其在保质期内的活菌存活率。此外，在新药研发阶段，科研人员通过计数测定来筛选耐酸、耐胆盐的优良菌株，为产品开发提供数据支持。

3. 饲料与养殖行业

随着“饲料禁抗”政策的全面实施，益生菌饲料添加剂成为替代抗生素的重要选择。在饲料生产企业和养殖场，双歧杆菌计数测定用于监控饲料添加剂的质量和添加效果。通过检测，养殖户可以科学投喂，调节动物肠道菌群平衡，提高免疫力，减少疾病发生，从而保障畜禽产品的食品安全。

4. 第三方检测与政府监管

各级市场监管部门在进行食品安全抽检、风险监测时，双歧杆菌计数是重要的抽检项目。第三方检测实验室受委托对市场流通产品进行检测，出具的CMA/CNAS检测报告具有法律效力。这不仅是对生产企业的监督，也是保护消费者权益的重要手段，有助于规范市场秩序，打击假冒伪劣产品。

5. 科学研究机构

在高校、科研院所的微生物学、营养学研究中，双歧杆菌计数测定是基础实验技术之一。科研人员利用该技术研究双歧杆菌的生物学特性、与宿主的相互作用机制、定植能力以及不同加工工艺对菌体活性的影响。这些基础研究为开发新型益生菌制剂和制定新的检测标准提供了理论依据。

常见问题

在进行双歧杆菌计数测定的过程中，无论是检测人员还是送检客户，经常会遇到一些技术难点和困惑。以下针对常见问题进行详细解答，以帮助相关方更好地理解和执行检测工作。

问：为什么检测出的双歧杆菌数量比产品标签上的数值低很多？
答：这种情况较为常见，原因通常有以下几点：一是储存运输条件不当，双歧杆菌对温度和湿度敏感，若冷链断裂或储存温度过高，会导致活菌快速死亡；二是检测时间的影响，产品随着保质期的延长，活菌数会自然衰减，如果在保质期末期检测，结果往往低于初始值；三是前处理方法不当，对于冻干粉或胶囊，若溶解不充分或稀释过程过激，会造成计数偏低；四是检测方法的差异，不同实验室或不同标准（如国标与行标）在培养基选择、培养条件上存在差异，可能导致结果偏差。建议严格按照标准方法检测，并关注产品的储存状态。
问：如何确保厌氧环境的有效性？
答：厌氧环境的构建是检测成功的关键。除了使用厌氧工作站外，使用厌氧罐时必须检查密封性。每次培养时应放置厌氧指示剂，观察颜色变化（如由蓝色变为无色），以确认罐内确已达到厌氧状态。同时，培养基中应适量添加还原剂（如L-半胱氨酸盐酸盐），并在使用前进行预还原处理，降低培养基的氧化还原电位。
问：平板上长出的菌落形态不一致，如何判断哪些是双歧杆菌？
答：在选择性培养基上，双歧杆菌的典型菌落通常为光滑、湿润、乳白色或灰白色、边缘整齐的圆形菌落。如果出现形态差异较大的菌落，可能是杂菌污染或非目标乳酸菌。此时，应挑取不同形态的菌落进行革兰氏染色镜检和过氧化氢酶试验。双歧杆菌为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性。必要时，需通过生化鉴定管或分子测序进行确证。
问：qPCR法和平板法哪个更好？
答：两种方法各有优劣。平板法是经典方法，能反映样品中的活菌数，是法规认可的仲裁法，但耗时较长（需2-3天）。qPCR法快速、特异，适合高通量筛选，但容易受死菌DNA干扰，且设备和试剂成本较高。对于质量控制和产品放行，推荐使用平板法；对于研发阶段的快速评估，可辅以qPCR法。
问：样品运输对检测结果有何影响？
答：样品运输是影响结果的重要环节。对于液体样品或需要保持活性的样品，必须采用冷链运输（冷藏或冷冻），并避免反复冻融。样品送达实验室后应尽快检测，常温放置时间过长会导致双歧杆菌活性大幅下降。对于粉末样品，虽对温度要求相对较低，但也应避光、防潮，防止吸湿变质。