志贺氏菌检验

技术概述

志贺氏菌（Shigella）是一类重要的肠道致病菌，属于肠杆菌科，是引起人类细菌性痢疾的主要病原体。志贺氏菌检验是指通过一系列标准化的微生物学检测方法，对食品、饮用水、环境样品以及临床标本中的志贺氏菌进行分离、鉴定和确认的检测过程。该检验对于保障食品安全、防控传染病传播以及维护公共卫生具有重要意义。

志贺氏菌为革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无荚膜、无鞭毛，不运动。根据其生化反应和抗原结构的不同，志贺氏菌可分为四个菌群：痢疾志贺氏菌（A群）、福氏志贺氏菌（B群）、鲍氏志贺氏菌（C群）和宋内氏志贺氏菌（D群）。其中，福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌在我国较为常见。志贺氏菌主要通过粪-口途径传播，感染者可出现发热、腹痛、腹泻、黏液脓血便等症状，严重时可导致脱水、电解质紊乱甚至死亡。

志贺氏菌检验技术经过多年发展，已形成较为完善的检测体系。传统检测方法主要依靠培养分离、生化鉴定和血清学凝集试验，检测周期通常需要3至5天。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术、实时荧光定量PCR、基因芯片、质谱技术等新型检测手段逐步应用于志贺氏菌的快速检测，大大缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度和特异性。

在食品安全监管体系中，志贺氏菌被列为重要的食源性致病菌之一。我国《食品安全国家标准 食品微生物学检验》（GB 4789系列）中明确规定了志贺氏菌的检验方法。世界卫生组织（WHO）也将志贺氏菌列为全球重点监测的肠道病原菌。因此，建立健全志贺氏菌检验能力，对于食品生产企业、检验检测机构、疾病预防控制部门等具有重要的现实意义。

检测样品

志贺氏菌检验涉及的样品类型广泛，主要涵盖食品、饮用水、环境样品和临床标本等多个领域。不同类型的样品具有不同的基质特性和微生物群落结构，因此在前处理方法和检测策略上存在一定差异。

食品类样品是志贺氏菌检验的主要对象。包括但不限于以下类别：

• 肉与肉制品：生鲜肉、熟肉制品、腌制肉制品等
• 乳与乳制品：鲜乳、巴氏杀菌乳、乳粉、发酵乳等
• 水产品：鱼类、虾蟹类、贝类等生鲜及加工制品
• 果蔬制品：新鲜果蔬、果蔬汁、速冻果蔬等
• 即食食品：沙拉、三明治、糕点、盒饭等
• 调味品：酱油、醋、酱类等

饮用水及水源水样品也是志贺氏菌检验的重要对象。包括生活饮用水、矿泉水、纯净水、地表水、地下水、游泳池水等。水源性传播是志贺氏菌感染的重要途径之一，水质监测对于防控志贺氏菌病具有重要意义。

环境样品主要包括食品生产加工环境的涂抹样品、餐具消毒效果监测样品、污水样品等。环境监测有助于评估食品生产场所的卫生状况，追溯污染来源。

临床标本主要包括腹泻患者的粪便标本、肛拭子等。临床检验是确诊志贺氏菌感染的金标准，对于疾病的诊断、治疗和流行病学调查具有重要价值。

检测项目

志贺氏菌检验的主要检测项目包括定性检测、定量检测、分型鉴定和药敏试验等多个方面，具体检测内容根据检验目的和样品类型进行选择。

定性检测是最常见的检测项目，用于判定样品中是否存在志贺氏菌。检测结果以"检出"或"未检出"表示，并注明检测所用样品量。定性检测主要依据国家标准方法，通过增菌培养、分离培养、生化鉴定和血清学凝集等步骤完成。

菌群鉴定是确定志贺氏菌所属菌群的重要检测项目。根据生化反应特点和O抗原的差异，志贺氏菌可分为四个菌群：

• A群（痢疾志贺氏菌）：共有15个血清型，不发酵甘露醇
• B群（福氏志贺氏菌）：共有13个血清型，发酵甘露醇
• C群（鲍氏志贺氏菌）：共有18个血清型，发酵甘露醇
• D群（宋内氏志贺氏菌）：仅有1个血清型，迟缓发酵乳糖

血清学分型是在菌群鉴定的基础上，进一步确定菌株血清型的检测项目。通过玻片凝集试验，使用相应的抗血清与待检菌株进行反应，根据凝集结果确定菌株的血清型别。血清分型对于流行病学调查、传染源追踪具有重要意义。

药物敏感性试验是评估志贺氏菌对抗菌药物敏感性的检测项目。由于抗生素的广泛使用，志贺氏菌的耐药性问题日益严重，药敏试验结果可为临床治疗用药提供科学依据。常用的药敏试验方法包括纸片扩散法、微量肉汤稀释法等。

分子生物学检测项目包括毒力基因检测、耐药基因检测、分子分型等。常见的毒力基因有侵袭蛋白基因、志贺毒素基因等；分子分型方法包括脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）等，可用于流行病学溯源分析。

检测方法

志贺氏菌检验方法经历了从传统培养法到现代分子检测方法的发展历程，目前形成了多种方法并存、各有优势的检测技术体系。

一、传统培养法

传统培养法是志贺氏菌检验的金标准方法，也是各国法规标准中规定的主要检测方法。我国现行标准为《食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》（GB 4789.5-2012）。检测流程主要包括以下步骤：

增菌培养：取适量样品接种于志贺氏菌增菌液（如GN增菌液）中，于36±1℃培养6至18小时。增菌培养可以使目标菌在样品中富集，提高检出率。对于某些含杂菌较多的样品，可适当延长增菌时间或调整增菌条件。

分离培养：将增菌培养液划线接种于选择性分离培养基上，常用的分离培养基包括麦康凯琼脂（MAC）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）、志贺氏菌沙门氏菌琼脂（SS琼脂）、HE琼脂等。于36±1℃培养20至24小时后，观察菌落形态特征。志贺氏菌在选择性培养基上通常形成无色透明或半透明、中等大小、光滑湿润的菌落。

初步生化鉴定：挑取可疑菌落接种于三糖铁琼脂（TSI）斜面和葡萄糖半固体管中。志贺氏菌在TSI上表现为斜面产碱（红色）、底层产酸（黄色）、不产硫化氢；在半固体管中无动力。同时可进行氧化酶试验，志贺氏菌氧化酶阴性。

生化确认试验：对初步生化鉴定符合志贺氏菌特征的菌株，进一步进行生化确认试验。常用的生化试验包括：甘露醇发酵试验、乳糖发酵试验、蔗糖发酵试验、水杨苷发酵试验、西蒙氏枸橼酸盐利用试验、赖氨酸脱羧酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验、精氨酸双水解酶试验等。志贺氏菌的生化反应特征为：不发酵乳糖（宋内氏志贺氏菌可迟缓发酵）、不产硫化氢、不利用枸橼酸盐、无动力、氧化酶阴性。

血清学鉴定：生化鉴定确认的菌株需进行血清学凝集试验。首先用志贺氏菌四种多价血清进行玻片凝集试验，凝集阳性者再用各群单价血清进行分群鉴定。凝集试验时应设置生理盐水对照，排除自凝现象。

二、免疫学检测方法

免疫学检测方法基于抗原-抗体特异性结合的原理，具有操作简便、检测快速的优点。主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法、胶体金免疫层析法等。这些方法可用于志贺氏菌的快速筛查，阳性结果需通过传统培养法确认。

三、分子生物学检测方法

分子生物学检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测周期短的优点，近年来发展迅速。

聚合酶链式反应（PCR）：通过扩增志贺氏菌特异性基因片段（如ipaH基因、ial基因、virA基因等）进行检测。常规PCR方法需要通过凝胶电泳观察结果，存在操作繁琐、易污染等缺点。

实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光探针或荧光染料，通过实时监测荧光信号变化进行定量或定性分析。该方法具有灵敏度高、特异性强、可定量、闭管操作减少污染等优点，已被广泛应用于志贺氏菌的快速检测。

等温扩增技术：如环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）等，无需热循环设备，反应温度恒定，设备要求低，适合现场快速检测。

基因芯片技术：将多种病原菌的特异性探针固定于芯片上，可同时检测多种食源性致病菌，适用于高通量筛查。

四、质谱检测技术

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术通过检测细菌核糖体蛋白的质谱图与数据库比对进行菌种鉴定。该方法具有快速、准确、通量高等优点，已逐步应用于临床和食品微生物鉴定领域。

检测仪器

志贺氏菌检验涉及多种仪器设备，不同检测方法所需的仪器配置存在差异。以下按检测流程介绍主要的检测仪器。

样品前处理设备

• 均质器：用于样品的均质化处理，包括拍打式均质器和旋转式均质器
• 电子天平：用于样品称量，精度一般要求达到0.01g
• 离心机：用于样品离心沉淀，收集菌体或去除杂质
• 涡旋振荡器：用于样品和试剂的混匀
• 过滤装置：用于水样等液体样品的膜过滤浓缩

培养设备

• 恒温培养箱：用于微生物的培养，温度精度要求±1℃，常用温度为36±1℃
• 厌氧培养系统：用于厌氧菌的培养，包括厌氧罐、厌氧袋、厌氧工作站等
• 二氧化碳培养箱：某些特定培养条件下使用
• 恒温水浴锅：用于培养基加热溶解、保温等

显微观察设备

• 光学显微镜：用于观察细菌形态、染色特性等
• 相差显微镜：可观察活菌形态和运动性
• 荧光显微镜：配合荧光染色使用

生化鉴定系统

• 手工生化鉴定管：传统的生化鉴定方法，成本较低
• 自动化生化鉴定系统：如VITEK系统、BD Phoenix系统等，可自动完成生化鉴定，提高检测效率和准确性
• API鉴定系统：半自动化的生化鉴定系统，操作简便，结果可靠

分子检测设备

• PCR扩增仪：常规PCR扩增的必备设备
• 实时荧光定量PCR仪：可进行荧光定量PCR检测
• 电泳系统：包括电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统等
• 核酸提取仪：自动化提取核酸，提高效率并减少污染
• 超净工作台/生物安全柜：提供无菌操作环境

质谱检测设备

• MALDI-TOF MS系统：包括基质辅助激光解吸电离源和飞行时间质量分析器

其他辅助设备

• 高压蒸汽灭菌器：用于培养基、器皿等的灭菌
• 纯水机：制备实验用纯水
• 冷藏冷冻设备：用于样品和试剂的保存
• pH计：用于培养基pH值的测定和调整

应用领域

志贺氏菌检验在多个领域具有重要应用价值，为食品安全监管、疾病预防控制、公共卫生管理等提供技术支撑。

食品安全领域

食品安全是志贺氏菌检验最主要的应用领域。食品生产企业需要对原料、半成品和成品进行志贺氏菌检测，确保产品符合国家食品安全标准要求。餐饮服务单位需要对即食食品、餐具等进行卫生监测。食品监管部门对市场上流通的食品进行监督抽检，保障消费者权益。进出口食品检验检疫中，志贺氏菌是重要的检测项目，确保进出口食品安全。

饮用水卫生领域

饮用水安全直接关系人民群众身体健康。志贺氏菌作为重要的水源性病原菌，是饮用水卫生监测的重要指标之一。供水企业需要对出厂水进行定期检测，卫生监督部门对管网末梢水进行监督监测，确保饮用水卫生安全。矿泉水、纯净水等包装饮用水产品也需进行志贺氏菌检测。

疾病预防控制领域

疾病预防控制机构承担着志贺氏菌病的监测、调查和防控工作。通过对腹泻病例标本进行志贺氏菌检验，可及时发现和确诊病例，为临床治疗提供依据。在疫情暴发调查中，通过对病例和环境样品的检测分析，可追溯传染源、确定传播途径，为制定防控措施提供科学依据。志贺氏菌的血清分型和分子分型结果对于流行病学调查和溯源分析具有重要价值。

临床医学领域

临床实验室对腹泻患者粪便标本进行志贺氏菌检验，是确诊细菌性痢疾的关键手段。检测结果可指导临床医生合理选择抗菌药物，提高治疗效果。同时，药敏试验结果可为临床用药提供参考，减少抗生素滥用和耐药菌产生。

环境卫生领域

食品生产加工企业的环境卫生直接影响产品安全。通过对生产环境（包括设备表面、操作台面、空气、人员手部等）进行志贺氏菌监测，可评估卫生状况、发现潜在风险、指导卫生改进。污水处理厂需要对出水进行病原菌监测，评估消毒效果，防止病原菌进入环境造成污染。

科研教育领域

志贺氏菌检验技术的研究和发展需要科研机构的持续投入。包括新检测方法的建立、快速检测试剂盒的研发、志贺氏菌致病机理研究、疫苗研发等。高等院校和科研院所开展志贺氏菌相关研究，为检验技术的发展提供理论和实践基础。

常见问题

问：志贺氏菌检验的标准方法是什么？

答：我国志贺氏菌检验的国家标准方法为《食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》（GB 4789.5-2012）。该方法规定了食品中志贺氏菌的检验程序和方法，包括增菌、分离、生化鉴定和血清学鉴定等步骤。此外，还有出入境检验检疫行业标准SN/T 1869-2007、SN/T 2754.7-2011等，分别针对不同类型样品的检验。国际上，ISO 21567:2004规定了食品和动物饲料中志贺氏菌的检测方法，美国FDA Bacteriological Analytical Manual（BAM）中也收录了志贺氏菌检测方法。

问：志贺氏菌检验的检测周期需要多长时间？

答：传统培养法的检测周期通常为3至5天。具体包括：增菌培养6至18小时、分离培养20至24小时、初步生化鉴定18至24小时、生化确认试验24至48小时、血清学鉴定数小时。如果需要进行药敏试验或分子分型，检测周期会相应延长。快速检测方法如实时荧光定量PCR可在数小时内获得结果，但阳性结果通常需要传统培养法确认。

问：志贺氏菌检验中如何避免假阴性结果？

答：避免假阴性结果需要从多个环节加以注意：首先，样品采集和运输过程要规范，确保样品新鲜、冷藏运输，避免志贺氏菌在运输过程中死亡；其次，增菌培养条件要适宜，包括培养基选择、培养温度、培养时间等；第三，分离培养基的选择要合理，建议同时使用两种以上选择性培养基以提高检出率；第四，挑取菌落数量要足够，一般建议挑取5个以上可疑菌落进行鉴定；第五，生化鉴定要全面，避免因单个生化试验结果偏差导致误判。

问：志贺氏菌与大肠埃希菌如何区分？

答：志贺氏菌与大肠埃希菌同属肠杆菌科，在形态和部分生化特性上存在相似之处，但可通过以下特征区分：动力方面，志贺氏菌无动力，大肠埃希菌通常有动力；产气方面，志贺氏菌发酵葡萄糖不产气，大肠埃希菌产气；乳糖发酵方面，志贺氏菌通常不发酵乳糖（宋内氏志贺氏菌迟缓发酵），大肠埃希菌发酵乳糖；赖氨酸脱羧酶试验，志贺氏菌阴性，大肠埃希菌通常阳性；吲哚试验，志贺氏菌部分阳性（痢疾志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌吲哚阴性，福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌吲哚阴性或阳性），大肠埃希菌吲哚阳性。

问：志贺氏菌检验的生物安全要求是什么？

答：志贺氏菌属于第二类病原微生物，检验活动应在符合生物安全二级（BSL-2）条件的实验室进行。实验室应配备生物安全柜、高压蒸汽灭菌器等设备，工作人员应经过专业培训并掌握生物安全操作规程。操作过程中应做好个人防护，穿戴实验服、手套等防护用品。样品处理、菌种操作等可能产生气溶胶的步骤应在生物安全柜中进行。废弃物应经高压灭菌后再行处置。菌种应按规定保藏和管理，防止泄露和滥用。

问：志贺氏菌快速检测方法的可靠性如何？

答：目前市售的志贺氏菌快速检测方法主要包括免疫学方法和分子生物学方法。免疫学方法如ELISA、胶体金试纸条等，操作简便、检测快速，但灵敏度相对较低，可能存在交叉反应，一般适用于样品的初筛。分子生物学方法如PCR、实时荧光定量PCR等，灵敏度高、特异性强，检测结果可靠，但需要专业设备和技术人员，且不能区分死菌和活菌。快速检测方法的阳性结果通常建议采用传统培养法进行确认。选择快速检测方法时，应注意方法是否经过验证，是否符合相关标准要求。

问：志贺氏菌检验中常见的污染杂菌有哪些？如何处理？

答：志贺氏菌检验中常见的污染杂菌包括大肠埃希菌、变形杆菌、沙门氏菌、假单胞菌等。这些杂菌在增菌和分离培养过程中可能干扰志贺氏菌的检出。处理方法包括：选择适宜的选择性增菌液，抑制杂菌生长；使用选择性分离培养基，如SS琼脂、XLD琼脂等，抑制杂菌生长并使志贺氏菌呈现典型菌落特征；挑取菌落时仔细观察，选择符合志贺氏菌特征的菌落；必要时可采用进一步增菌或延长培养时间提高目标菌比例。

问：志贺氏菌检验对样品有哪些特殊要求？

答：志贺氏菌检验对样品有以下要求：样品应具有代表性，采样量和采样点应符合标准要求；样品应在冷藏条件下运输，避免温度变化影响志贺氏菌存活；样品应尽快检验，一般要求在采样后24小时内开始检验，若不能及时检验，应冷冻保存；液体样品应充分混匀后取样，固体样品应均质处理后取样；冷冻样品应在冷藏条件下解冻，避免反复冻融；检验过程中应设置阴性对照和阳性对照，确保检验结果可靠。